Hinsichtlich der Durchführung der Wächterlymphknotenszintigraphie sind in der Regel keine besonderen Vorbereitungen seitens des Patienten erforderlich. Wie bei anderen Verfahren der Nuklearmedizin findet auch vor einer Wächterlymphknotenszintigraphie eine Patientenaufklärung statt, in der es unter anderem um Informationen zur Durchführung der Untersuchung und mögliche Kontraindikationen geht.

Was die Wächterlymphknotenszintigraphie von vielen anderen Bildgebungsverfahren unterscheidet: Die Anfertigung der Bilder erfolgt meist als unmittelbare Operationsvorbereitung. Anhand der Befunde wird das Resektionsareal festgelegt.

Nach der Aufnahme des Tracers erfolgt die radioaktive Markierung (zusätzlich kann ein Farbstoff zur besseren Unterscheidung des Gewebes verwendet werden), auf deren Basis die betroffenen Lymphknoten nach am selben oder dem darauffolgenden Tag chirurgisch entfernt werden. Häufig erfolgt dies zusammen mit der operativen Entfernung des eigentlichen Tumors. Anschließend erfolgt die histologische Untersuchung des Lymphknotengewebes auf das Vorhandensein von Krebszellen. Vom Ergebnis dieser Untersuchung hängt ab, ob im Rahmen der Operation nur die Wächterlymphknoten entfernt oder das Lymphknotenareal großflächiger reseziert werden muss. Liegt das Ergebnis der Untersuchung des Tumors erst nach einigen Tagen vor, erfolgen die Szintigraphie der Wächterlymphknoten und deren Entfernung in einem zweiten Eingriff.